Geometric Mean Titer (GMT/幾何平均效價) 計算方法

以下參考自中山附醫 陳志豪與臺大醫院小兒科黃立民醫師之研究報告

GMT是用來判斷免疫相關藥劑是否有效的依據。

以下四個參數將被使用在評估各家疫苗廠施打疫苗前後抗體效價變化的指標:幾何平均抗體效價 GMT (Geometric mean titer)、 血清轉換率seroconversion rate、 血清轉換係數 seroconversion factor 及血清保護率seroprotection rate.這些參數定義內容如下：

(1).Seroconversion factor (血清轉換係數)：打疫苗後平均抗體除以打疫苗前平均抗體的倍數；the fold increase in serum HAI titers after vaccination (the post-vaccination Ab titer divided by the pre-vaccination Ab titer)  

(2).Seroprotection rate (血清保護率)：HAI 抗體效價大於 40 的百分率; the percentage of vaccine recipients with a serum HAI titer at least 1:40 after vaccination

(3).Seroconversion rate (血清轉換率)：打疫苗後血 HAI 抗體效價呈四倍以上增加的比率；the percentage of vaccine recipients who have an increase in serum HAI titers by at least a factor of 4 after vaccination, as compared with titers before vaccination。

免疫力的判定,，是以偵側其抗體的量來定量。偵測的方法利用
1. HAI (hemagglutinin-inhibition) assay 紅血球凝集素抑制反應  
這是一種定抗體量的方法,，利用抗體和細胞受體去競爭與病毒的結合， 看需多少抗體才能阻止流感病毒對紅血球細胞造成破壞。此為血清轉換率 (serocoversion rate)"的檢測方法。
2. MN (Micro-Neutralization) assay 微中和反應檢定
利用病毒感染細胞會受到抗體的抑制的方法, 在細胞培養中加入抗體以避免病毒感染來測定抗體濃度，此為血清保護率 (seroprotection rates)檢定原理。



根據CPMP guidelines (European Committee for Proprietary Medicinal Products)定義：對18-60歲的成年人，血清轉陽率(seroconversion rate)必須大於40%；血清轉換係數(seroconversion factor) 必須大於2.5；血清保護率(seroprotection rate) 必須大於70%；對大於60歲的老年人，血清轉陽率(seroconversion rate) 必須大於30%；血清轉換係數(seroconversion factor) 必須大於2.0；血清保護率(seroprotection rate)必須大於60% (CPMP/BWP/214/96. September 1996; Circulaire No 96-0661 : 1 – 22.) 。由於沒有針對幼兒的標準，因此對於幼兒的部份本實驗採用大於60歲的老年人之標準。

以下 HAI assay 是參考世界衛生組織出版的動物流感診斷與監測手冊執行進行方法(WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance)及疾病管制局之方法。


紅血球懸浮液製備：
a.  以心臟採血方式抽天竺鼠血液並置於阿氏抗凝劑中，混合均勻。將血球用離心方式，以 pH7.2 磷酸鹽緩衝液洗三次，並製成 10﹪儲存儲存懸浮液，置 4℃冰箱備用，但不得超過一週。做試驗時配成 0.75﹪懸浮液。
b.  抗血清及病人血清之處理-為自血清中除去非特異性抑制因子。將0.1 ml 血 清 加 入 0.4 ml 接 受 器 摧 化 酶 （ Receptor destroy enzyme[RDE]，100unit/ml），於 37℃水箱作用一夜。加 0.3 ml 之 2.5﹪檸檬酸鈉 (Na citrate)，56℃水箱，靜置 30 分鐘。再加入 0.2 ml 磷酸鹽緩衝液（PBS），則血清最後稀釋度為 1/10。


血球凝集試驗
取 U 形底的 96 孔盤，於第二列至第八列加入 50 µl 的 PBS 溶液。於第一列加入100 µl 的病毒抗原原液，negative control 行則以 100 11µl PBS 取代抗原。取第一列的抗原 50 µl 加入第二列，以微量吸管充份混合後，再取 50 µl 加入第三列，如此序列稀釋至第八列分別加入以 PBS 稀釋的 0.75﹪的天竺鼠紅血球 50  µl/well，以手輕微搖晃孔盤後，之後以膠膜封住孔盤，置於室溫或 4℃下靜置 30∼60 分鐘，之後記錄結果。進行血球凝集抑制試驗前，須先以 PBS 溶液稀釋抗原原液至每 50 µl 稀釋液中含有 8 HA unit 的抗原。（1 HA unit 約為 107個病毒量）。 


血球凝集抑制試驗
取 U 形底的 96 孔盤，於第二列至第八列加入 25 µl 的 PBS 溶液於第 l一列加入 50 µl 的各標準病毒株的標準抗血清，negative control 行則以25 µl PBS 取代抗血清。取第一列的抗體 25 µl 加入第二列，以微量吸管充份混合後，再取 25 µl 加入第三列，如此序列稀釋至第八列分別加入 25 µl 已稀釋至 8 HA unit/50 µl 的待測抗原及標準抗原，以手輕微搖晃孔盤後，置於室溫下反應 60 分鐘。加入以 PBS 稀釋的0.75﹪的天竺鼠紅血球 50 µl/well，之後以膠膜封住孔盤，至於室溫或 4℃下靜置30∼60 分鐘，之後記錄結果。血球凝集抑制試驗以紅血球無凝集反應孔數最高者為所判定之抗體力價。 


數據分析
參考 Belshe et al., 2004 之 方 法 ， 以 Geometric mean titer、 12 seroconversion rate、 seroconversion factor 及 seroprotection rate 等作指標。(即是否合乎 guidelines of the European Committee for Proprietary Medicinal Products (CPMP) for the  annual relicensure of influenza vaccines”)